Häufig stellt sich nicht nur die Frage, welche Mikroorganismen in einem Habitat vorhanden sind, sondern auch welche Funktionen von der Mikrobiota übernommen werden können. Um diese Frage zu beantworten muss man das gesamte genomische Material untersuchen. Dabei werden die zu analysierenden Sequenzen mit bekannten vergleichen, so können die Funktionen identifizierter Gene einer Probe zugeordnet werden. Im Gegensatz zur Sequenzierung von 16S rRNA Genfragmenten, wird bei diesem Ansatz keine gezielte Sequenzierung ausgewählter Gene vorgenommen, sondern es wird das komplette genetische Material untersucht. Der Vorteil davon ist, dass keine Selektion von Organismen stattfindet und keine Amplifikation von DNA notwendig ist, die durch unterschiedliche Amplifikationseffizienzen zu Verschiebungen führen kann.

Die Mikrobiota kann durch Wechselwirkungen mit dem Wirt, diesen sowohl in positiver als auch negativer Hinsicht beeinflussen. Ein einfaches Beispiel hierfür ist die menschliche Verdauung. Einige Nährstoffe kann ein Mensch nicht verwerten, wenn diese nicht zuvor von Darmbakterien in eine Form gebracht werden, die vom Körper aufgenommen und weiterverarbeitet werden kann. Wird die Zusammensetzung der intestinalen Mikrobiota so verändert, dass diese Zusammenarbeit nicht mehr funktioniert, kann das negative Auswirkungen für den Menschen haben.

Aus qualitativ hochwertigen Proben wird die gesamte DNA isoliert. Anschließend werden Barcodes und Linkersequenzen für die Sequenzierung an die DNA-Fragmente angehängt. Dies findet unabhängig von der DNA Sequenz des Template Stranges statt, somit gibt es keine Selektion von Sequenzen. Die Nukleotidsequenz wird durch Next-generation-Sequencing bestimmt. Durch Vergleiche mit bekannten Sequenzen können die Funktionen von detektierten Genen zugeordnet werden, sowie die Zusammensetzung der Mikroorganismen im Ausgangsmaterial analysiert werden.

Applikationen

Untersuchung der Zusammensetzung des intestinalen Mikrobioms von Typ 2 Diabetes Patienten und gesunden Kontrollen zeigen geringere Mengen an bestimmten Butyrat produzierenden Bakterien, mehr opportunistische Pathogenen und eine Anhäufung von Funktionen für die Reduktion von Sulfaten und Resistenz gegenüber oxidativem Stress bei Patienten (Qin et al. (2012) Nature)

Trotz unterschiedlicher Zusammensetzung der Mikrobiota verschiedener Individuen bleiben die Funktionen erhalten (The Human Microbiome Project Consortium (2012) Nature)

Methoden

Zunächst wird die Qualität der eingesendeten Proben überprüft. Dabei ist es wichtig, dass die Proben während des Transportes ausreichend gekühlt und nicht beschädigt wurden. Zusätzlich wird überprüft, dass die projektspezifischen Probenbestimmungen erfüllt wurden. Die DNA wird nach einem etablierten Protokoll aus einer Probe extrahiert Nach Verifikation der DNA Qualität werden die Proben für die Sequenzierung entsprechend den Angaben von Illumina mit dem Nextera XT DNA Sample Prep Kit vorbereitet. Bei diesem Schritt wird die genomische DNA in Fragmente mit einheitlicher Länge unterteilt und diese werden anschließend mit Barcode- und Linkersequenzen versehen. Die Sequenzierung findet auf Illumina HiSeq2500 Geräten statt. Bei der anschließenden Datenverarbeitung werden zunächst die zuvor eingefügten Barcode- und Linkersequenzen entfernt und anschließend paired-end Reads zusammengefügt. Anschließend erfolgt eine Qualitätskontrolle der ca. 10 Millionen Reads pro Probe mit Hilfe des Programms PrinSeq. In einem weiteren Schritt werden die Sequenzen der Analyse mit bekannten und in Datenbanken hinterlegten Sequenzen verglichen. Durch diesen Vergliche kann auf Grund der Sequenzdaten bestimmt werden, welche Mikroorganismen (Vergleich gegen die NCBI Taxonomie) und welche Gene (Vergleich mit SEED, KEGG und COG Klassifikationen) in einer Probe enthalten waren. Über die Identifikation der Gene können dann Rückschlüsse auf die Funktionen, die von den Mikroorganismen ausgeführt werden, gezogen werden.