Sequenzierung von 16S rRNA Genfragmenten ermöglicht es sowohl zu bestimmen, welche Arten von Bakterien in einer Probe enthalten sind als auch Aussagen über deren Quantitäten zu treffen. Die 16S rRNA Gene sind innerhalb der Bakterien zu großen Teilen konserviert. Die konservierten und daher einheitlichen Bereichen werden aber immer wieder von Abschnitten, die zwischen den unterschiedlichen Bakterien variieren, unterbrochen. Durch sequenzieren dieser variablen Regionen erhält man Informationen über die Art der Bakterien, aus denen die DNA isoliert wurde.

Der Vorteil dieser Methode ist, dass mit wenig Sequenzieraufwand die bakterielle Zusammensetzung einer Probe bestimmt werden kann. Die Analyse ist allerdings auf Bakterien beschränkt. Es ist nicht möglich Aussagen über andere Mikroorganismen, die in einer Probe enthalten sind, zu machen.

Für diese Art von Analyse wird zunächst DNA aus einer Probe isoliert. Anschließend kann das zu analysierende Genfragment vervielfältigt und für die Sequenzierung vorbereitet werden. Für die Sequenzierung werden heutzutage meist Next-Generation-Sequencing Methoden verwendet. Der hohe Durchsatz ermöglicht es mit wenig Aufwand, verglichen zur Sanger Sequenzierung, in kurzer Zeit viele verschiedene DNA Sequenzen gleichzeitig zu Analysieren. Auf diese Art kann eine große Anzahl von Proben parallel analysiert werden, wodurch die Kosten pro Probe gering gehalten werden.

Nach Probeneingang wird zunächst die Qualität des Ausgangsmaterials überprüft und anschließend die gesamte DNA einer Probe isoliert. Die zur Identifikation gewählte Region des 16S rRNA Gens wird zunächst durch gezielte Amplifikation angereichert. In einem weiteren Schritt werden 2 kurze DNA Sequenzen an die Amplikons angehängt; eine dient der Probenzuordnung, die andere wird für die Sequenzierung benötigt. Während der Sequenzierung wird dann die Basenabfolge der zu Untersuchenden DNA bestimmt. Die Daten der Sequenzierung werden anschließend zunächst so aufbereitet, dass keine fehlerhafte Sequenzen verwendet werden, dann kann die Zuordnung von DNA Sequenzen und Bakterienart, sowie eine Quantifizierung stattfinden.

Applikationen

Untersuchung der bakteriellen Besiedlung des Darms bei Normal- und Übergewichtigen Zwillingen. Die Resultate zeigen einen geringeren Anteil an Bacteroidetes und mehr Actinobacteria bei übergewichtigen als bei normalgewichtigen Menschen. (Turnbaugh et al. (2009) Nature)

Entwicklung der intestinalen Mikrobiota: Bei Neugeborenen dominieren zunächst die Bifidobacterien und es gibt große Unterschiede zwischen Kindern. Im laufe der Zeit steigt die Diversität der Mikrobiota und innerhalb der ersten 3 Jahre etabliert sich eine stabilere, mit Erwachsenen vergleichbare Zusammensetzung. (Yatsunenko et al. (2012) Nature)

Identifizierung bestimmter Bakterien, die in Zusammenhang mit kolorektalen Karzinomen stehen. (Geng et al. (2014) Gut Pathogens)

Nachweis von Pathogenen, die Cystische Fibrose verursachen und mit Standardmethoden nicht identifiziert werden konnten. (Salipante et al. (2013) PLOS ONE)

Methoden

Zunächst wird die Qualität der eingesendeten Proben überprüft. Dabei ist es wichtig, dass die Proben während des Transportes ausreichend gekühlt und nicht beschädigt wurden. Zusätzlich wird überprüft, dass die projektspezifischen Probenbestimmungen erfüllt wurden. Die DNA wird nach einem etablierten Protokoll aus einer Probe extrahiert. Nach Verifikation der DNA Qualität findet die Probenvorbereitung für die Sequenzierung statt. Die Amplifikation der für die Sequenzierung ausgewählten Region und das Anhängen von Barcode- und Linkersequenzen findet nach etablierten Protokollen statt (Illumina, Caporaso et al.). Die Sequenzierung findet auf einem Illumina MiSeq Gerät statt. Bei der anschließenden Datenverarbeitung werden zunächst die zuvor eingefügten Sequenzen entfernt und anschließend die paired-end Reads zusammengefügt. Anschließend erfolgt eine Qualitätskontrolle der Sequenzierdaten mit Hilfe des Programms PrinSeq. Zuletzt werden die Sequenzen durch Vergleich gegen die NCBI Taxonomie mit dem „Lowest Common Ancestor“ (LCA) Algorithmus Bakterien zugeordnet und es wird ein Bericht über die Zusammensetzung der Mikrobiota der untersuchten Probe erstellt.